La intervención se realiza en quirófano, con anestesia local tópica en gotas para quitarle sensibilidad al ojo y sedación. A continuación, se realizan tres microincisiones (inferiores a 1 mm) en la esclera, a través de las cuales se accede a la cavidad vítrea para realizar la intervención. Durante la misma, se extrae el humor vítreo, y se realizan diferentes maniobras para mejorar patologías oculares, tales como, retirar tejido cicatricial de la retina, extraer una catarata o cualquier objeto que no debería estar en el ojo, reposicionar la retina en casos de desprendimiento, entre otras.

Para realizar estas acciones, la vitrectomía se puede combinar en el mismo acto quirúrgico con otros procedimientos, como la fotocoagulación, la criocoagulación, la cirugía de catarata con o sin implante de lente intraocular, la cirugía de glaucoma, la colocación de implantes de silicona o las inyecciones intraoculares, entre otros.

Durante la intervención y de acuerdo al caso a tratar, para reemplazar el vítreo se inyecta una solución salina o una burbuja de aire o gas en la cavidad ocular (con el tiempo, esta burbuja se va absorbiendo progresivamente y desaparece por sí sola). En otras ocasiones, se usa aceite de silicón, que no desaparece naturalmente y para extraerse se necesitará de una segunda cirugía.